Quin seria el problema si les bandes no apareixen a Western Blot?

Resposta:

Molts …

Explicació:

Hi ha moltes raons per les quals és possible que les bandes no apareguin en un western blot. Han funcionat les combinacions de mostres i anticossos en el passat?

A continuació, s’enumeren alguns que puc pensar en el moment que puguin fer que les bandes no apareguin:

1. Es va transferir la proteïna del gel? Intenteu tacar la membrana amb una mena de ponceau S o amido negre per veure si les bandes estan presents. De vegades, podeu veure les bandes de proteïnes de la membrana mullant-la i agafant-la en angle.

2. Funciona l’anticòs primari? Això és difícil de provar i l'única manera de fer-ho és incloure un control positiu en el qual sàpigues que tens la proteïna d'interès present. Si teniu algunes de les proteïnes d’interès, podeu provar d’observar-la a la membrana Western blot (és a dir, que no feu el gel) i veure si obteniu un resultat si processeu la membrana com si es tractés d’un western blot.

3. És que l’anticòs secundari reconeix l’anticòs primari? Una vegada més, és difícil provar-ho. Sobre l’única prova que podeu fer és la prova puntual esmentada anteriorment a la 2.

4. El "sistema de detecció" funciona? Depenent del mètode de detecció que esteu utilitzant, podeu provar de detectar alguns dels anticossos secundaris per veure si la solució de detecció, i també l'agent desencadenant de l’anticòs secundari, funciona. És a dir, podeu activar la reacció només amb l’anticòs secundari?

Finalment, podria ser tan simple com una de les solucions utilitzades durant el sondeig de la parcel·la fent-se incorrectament. Per exemple, si la concentració de sal és incorrecta en el buffer, això pot provocar que els anticossos s’alliberin de la taca. El mateix també passaria si el pH dels buffers fos incorrecte.

La causa més "estranya" d’un western blot que no vaig treballar personalment va ser quan vam canviar el proveïdor de la llet en pols que vam utilitzar per bloquejar la membrana. La pols del nou proveïdor contenia una fosfotirosina fosfatasa que va eliminar tots els grups fosfats que intentàvem detectar amb el nostre anticòs anti-fosfotirosina.